微生物质控之支原体快速检测方法

支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

支原体是实验室中常见的污染源，据统计约有15%-35%的细胞被支原体污染。污染的主要来源有：工作环境污染、操作者本身污染、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染会改变细胞内DNA、RNA及蛋白表达，改变宿主细胞的结构和功能，影响细胞代谢和生长，具有干扰病毒复制的不利影响。

相法规及指导原则

中国药典2020版<3301支原体检查法>：进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。
日本药典（JP）14：提供三种检测方法：1）培养法；2）指示细胞培养法；3）PCR法。
欧洲药典（EP）2.6.7及美国药典（USP）<63>：提供三种检测方法：1）琼脂和肉汤培养法；2）指示细胞培养法；3）核酸扩增技术（NAT）。（经过评估后需与前两种方法有可比性，才可作为替代方法）
FDA：提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。
ICHQ5D：提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。
免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）：对微生物污染和微生物代谢产物/衍生物污染的安全性研究，如真菌、细菌、支原体、病毒、内毒素等进行安全性研究。
细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点：病毒和细胞的载体质量标准应包括支原体等。部分支原体种类对人和动物有致病性，存在一定的生物安全风险，因此，支原体检验也是生物制品行业规定的必检项目。
培养法和指示细胞法在实际应用中，存在检测周期较长的缺点，不满足有效期短的产品或需要快速放行的中间品。君研生物为了寻求既满足法规检测需求，又快速方便的检测方式，开发了支原体检测试剂盒。

支原体DNA（qPCR）检测试剂盒

君研生物自主研发的支原体DNA（qPCR）检测试剂盒M0311A-50专一性强，灵敏度高，可用于定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞中是否存在支原体污染，可与君研生物“宿主细胞残留DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒”以及全自动核酸提取仪配套使用。本试剂盒的优势在于可覆盖150多种支原体检测，检测限、精密度、耐用性好、专属性强。

产品性能参数

检测限

对10种标准菌株（10CFU/mL）分别做24次提取并检测，检出率达100%。

空白限

将DNA稀释液进行24次检测，同时将DNA稀释液进行24次提取并检测，结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰，CY5通道Ct值＜40且有明显扩增曲线。

精密度

将阳性样本重复10次检测，FAM通道和CY5通道Ct值CV值<5%。

专属性

1.将PBS、10%胎牛血清、10%马血清、支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、NK培养基、CHO无血清培养基、DMEM培养基等作为样本进行提取检测，检测结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰，CY5通道Ct值＜40且有明显扩增曲线，对支原体DNA（qPCR）检测试剂盒无干扰。

2.将常见生物制品（例如：CHO、E.coli、毕赤酵母、MDCK、PG13、Vero等）300pg/μL基因组DNA，其他工程菌乳杆菌（发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌等）、链球菌（嗜热链球菌、酿脓链球菌等）、梭菌（丁酸梭菌、生孢梭菌等）作为样本进行提取检测，检测结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰，CY5通道Ct值＜40且有明显扩增曲线，对支原体DNA（qPCR）检测试剂盒无交叉反应。

耐用性

1.支原体标准菌株在不同稀释基质（如DMEM培养基、CHO无血清培养基等）、产品冻融，产品运输、多种机型改变（如ABI7500，Bio-RadCFXOpus96，RocheLightCycler96等）情况下均可以稳定检出。

2.经验证，106细胞数的SIHA细胞、HCC827细胞和干细胞、5%人血白蛋白和1mg/mL的质粒DNA等样本基质不影响支原体DNA（qPCR）检测试剂盒和宿主细胞残留DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒的提取与检测。

联合验证

与第三方机构合作，在欧洲药典指导下，用培养法、指示细胞培养法和qPCR的同步实验分别检测10CFU/mL、100CFU/mL的口腔支原体和肺炎支原体，进行可比性研究。结果显示100CFU/mL的口腔支原体和肺炎支原体指示细胞法检测为阳性；10CFU/mL和100CFU/mL的口腔支原体、肺炎支原体培养法及支原体DNA（qPCR）检测试剂盒检测均为阳性，三种检测方法具有可比性。